The Effect of Effector Gene CfE15 on Conidia Production of Colletotrichum fructicola in Strawberry

Zhang Liqing ^1,2　Yu Yongting ^1,2　Fang Xianping ^1,2　Li Shuigen ^1,2　Zhang Xueying ^1,2*

1 Forest & Fruit Research Institute, Shanghai Academy of Agriculture Science, Shanghai, 201403; 2 Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai, 201403

*Corresponding author, zhangxueying@saas.sh.cn
Abstract　Strawberry anthracnose, caused by Colletotrichum species, is one of the most serious diseases of strawberry production worldwide. C. fructicola was the dominant species of strawberry anthracnose in East China. Effectors play important roles in the interaction between fungus and plants, and the pathogenicity mechanism of effectors is a research hotspot. In our previous studies, the effectors of C. fructicola were predicted based on the results of transcriptome. One candidate effector named as CfE15, which was significantly up-regulated in strawberry infected by C. fructicola, was chosen for further study. CfE15 encodes a small secreted cysteine-rich protein. Bioinformatics analysis showed that CfE15 encodes a 109-amino-acid (aa) polypeptide with the molecular mass of 11.6 kD and isoelectric point of 4.45. The N-terminal of CfE15 protein contains a 24-aa signal peptide sequence. The secondary structure of CfE15 was mainly composed of α-helix (3%), β strands (33%), extended strands (17.43%), β-turns (7.34%) and random coils (66.97%). CfE15 gene knockout vector pKH-CfE15 and complementary vector pKN-CfE15 were constructed. The gene deletion and complementary strains, ΔCfE15 and ΔCfE15C, respectively, were obtained by PEG mediated protoplast transformation and homologous recombination. No significant differences were observed in mycelial growth, morphology and conidia morphology among wild type (WT), ΔCfE15 and ΔCfE15C strains. The amount of conidia production of ΔCfE15 strain was significantly lower than that of WT and ΔCfE15C strain, and there was no difference between the wild type and ΔCfE15C. Our results provide a theoretical basis for elucidating the pathogenicity mechanism of C. fructicola and the interaction between C. fructicola and strawberry.

Keywords　Colletotrichum fructicola; Effectors; CfE15 gene; Conidial production

草莓(Fragaria×ananasa Duch.)属蔷薇科(Rosaceae)，多年生草本植物，为中国传统的优秀果品之一。中国已经成为世界上最大的草莓生产国和出口国之一。2016年，全球草莓产量为920万吨，其中中国占41%。然而，随着草莓产业的发展，草莓病害有逐年上升趋势，尤其以草莓炭疽病为代表的草莓主要病害，危害严重的年份直接导致减产50~80% (Xie et al., 2010)，甚至绝产。

“草莓炭疽病”指所有炭疽菌属(Colletotrichum spp.)真菌引起的草莓病害。以往报道草莓炭疽病的炭疽菌属真菌主要为：尖孢炭疽菌(C. acutatum)、胶孢炭疽菌(C. gloeosprioides)和草莓炭疽菌(C. fragariae) (Denoyes-Rothan et al., 2003)。后经多基因序列分析和形态学鉴定，C. acutatum和C. gloeosprioides已被定义为复合种，分别包含36和38个菌种(Damm et al., 2012; Weir et al., 2012; Marin-Felix et al., 2017)。草莓炭疽菌(C. fragariae)更名为C. theobromicola，属于C. gloeosprioides复合种(Denoyes-Rothan et al., 2003)。其中，果生炭疽菌C. fructicola (属C. gloeosprioides复合种)为华东地区草莓炭疽病菌的优势种(Zhang et al., 2020)。

效应子是由病原菌分泌的的一类外泌型蛋白分子，一方面促进病原菌的成功侵染、另一方面诱导寄主的防卫反应(Kamoun, 2007)。目前已经对一些效应子的功能进行了深入地研究。如玉米黑粉菌(Ustilago maydis)效应子CMU1，能够催化寄主的莽草酸途径中分支酸变换为预苯酸，从而干扰水杨酸的合成。许多病原真菌会分泌具有LysM (赖氨酸基序)结构域的效应子，以保护真菌细胞壁免受植物的几丁质酶作用或隔离释放的壳寡糖，从而避免被植物的防御系统识别(Liu et al., 2019)，如稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)效应子SLP1和番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)效应子ECP6和AVR4 (de Jonge et al., 2010; Mentlak et al., 2012)。

在已知的炭疽菌属真菌基因组中，果生炭疽菌编码数量最多的候选效应子基因。有关果生炭疽菌效应子的功能研究还相对较少。目前报道的效应子CfEC92对果生炭疽菌的致病力有影响，在侵染早期作为植物免疫抑制剂起作用(Shang et al., 2020)。到目前为止，大多数真菌效应蛋白的大小相对较小(通常小于200个氨基酸)，并且含有较高的半胱氨酸(cysteine, Cys)残基百分比(2~20%)，由此可见这类小分子量富含半胱氨酸的分泌蛋白(small secreted cysteine-rich proteins, SSCP)是真菌效应子的重要组成部分(Lu and Edwards, 2016)。

前期研究中通过转录组测序，发现了一个在侵染过程中上调表达的具有SSCP特征的效应子候选基因CfE15，该效应子的同源基因在其他炭疽菌中尚未见报道，本研究对CfE15进行了克隆及生物信息学分析，采用同源重组和原生质体转化，获得了CfE15的基因缺失突变菌株和互补菌株，并对野生型菌株、CfE15的基因缺失突变菌株和互补菌株的基本生长情况及孢子形态和产量进行了分析。本研究结果为进一步分析该候选效应子的的生物学功能提供一定基础。

1结果与分析

1.1果生炭疽菌CfE15基因的克隆和生物信息学分析

以果生炭疽菌cDNA为模板，扩增得到CfE15全长CDS(图1A)，与理论分子量一致(330 bp)。CfE15基因编码总长109个氨基酸(aa)，分子量约11.6 kD，等电点pI为4.45的多肽，且该蛋白不含任何已知的蛋白结构域(表1)。利用Signal P 4.0 Server对CfE15的信号肽分析表明CfE15蛋白N端含有一段24个aa的信号肽序列，其24位的丙氨酸(A)和25位的丝氨酸(S)之间存在一个剪切位点(图1B)。二级结构预测结果(图1C)表明，主要由α-螺旋(3%)、β股(33%)、延伸链(17.43%)、β-转角(7.34%)及无规则卷曲(66.97%)组成该蛋白的二级结构。利用NetNGly1.0和NetPhos 3.1进行蛋白质的N-糖基化和N-磷酸化预测，发现CfE15蛋白含有一个糖基化位点(图1D)，且存在磷酸化位点，共包括4个丝氨酸、2个苏氨酸和1个酪氨酸存在磷酸化活性位点(图1E)。

1.2果生炭疽菌CfE15基因敲除载体的构建

参照果生炭疽菌(C. fructicola) Nara gc5菌株全基因组序列(GenBank登录号：ASM31963v2)的基因组为模板，根据同源重组的原理(图2A)，利用CfE15基因的上、下游同源臂序列左臂引物E15UF/UR和右臂引物E15DF/DR分别进行扩增，得到左臂片段850 bp和右臂片段874 bp (图2B)。通过USER酶将基因左臂序列、右臂序列连接到酶切处理后的pKH-CfE15载体后送样测序，结果与预测序列一致，从而获得CfE15基因敲除载体。
 

1.3 CfE15基因缺失突变株的筛选与鉴定

敲除载体pKH-CfE15经过Kpn Ⅰ线性化后，通过原生质体转化法转化至野生型菌株的原生质体中，利用同源重组的原理分别将野生型菌株中的CfE15基因替换成潮霉素基因Hph。通过向培养基中添加潮霉素选出潮霉素抗性转化子并利用基因特异的引物来检测目的基因是否被敲除(CfE15F/CfE15R, E15UF/E15DR, H850/H852) (图3)。

1.4 CfE15基因互补载体的构建与鉴定

以果生炭疽菌基因组DNA为模板，利用特异性引物E15F+/ E15R+扩增CfE15全长及其启动子和终止子序列，连接到pKN载体的Kpn I/BamHI位点上，获得CfE15基因的互补载体(图4A)，电泳检测结果表明扩增的产物条带单一，序列长度2 991 bp (图4B)，测序验证正确。选取ΔCfE15为回复对象，通过pKN-CfE15C互补载体进行原生质体转化，并向培养基中添加遗传霉素(G418)选出具有遗传霉素抗性的转化子，利用特异的引物(CfE15F/CfE15R)对其进行PCR验证(图4C)，确定获得CfE15基因的互补菌株。

1.5野生型菌株、CfE15突变菌株及互补菌株基本生长情况的测定

菌落培养生长7 d后(图5A)，ΔCfE15的菌落直径与野生型菌株和互补菌株ΔCfE15C相比无显著差异，总体上生长情况比较一致(图5B)。

1.6孢子形态和产孢能力分析

野生型菌株、ΔCfE15以及互补菌株ΔCfE15C在孢子形态方面无显著差异(图6A)。为了明确ΔCfE15对分生孢子产孢能力的影响，对果生炭疽菌野生型菌株、ΔCfE15和互补菌株ΔCfE15C进行产孢量测定，结果发现ΔCfE15的孢子产量明显低于野生型菌株和互补菌株ΔCfE15C的孢子产量(P < 0.05) (图6B)。由此推测，CfE15基因在调节果生炭疽菌分生孢子的产量中发挥重要作用。

2讨论

近十年来，植物病原真菌产生的具有SSCP特征的效应子成为了研究的热点。在子囊菌纲的一些真菌中，已经证明了此类效应子在调控真菌致病性及寄主植物抗性中的作用(Stergiopoulos and de Wit 2009; Oliver et al., 2012)。但在果生炭疽菌中还未开展广泛的研究。

本研究结合前期转录组测序结果及SSCP的特征筛选获得了一个在侵染过程中上调表达的具有SSCP特征的效应子候选基因CfE15。对CfE15进行了克隆及生物信息学分析，发现该基因编码的蛋白含有109个氨基酸，该蛋白N端含有一段24个氨基酸的信号肽序列，不含任何跨膜结构域，此外该蛋白不含任何已知的蛋白结构域。该蛋白的二级结构主要由α-螺旋(3%)、β股(33%)、延伸链(17.43%)、β-转角(7.34%)及无规则卷曲(66.97%)组成。含有一个糖基化位点，且存在磷酸化位点，共包括4个丝氨酸、2个苏氨酸和1个酪氨酸存在磷酸化活性位点。

果生炭疽菌为半活体营养型真菌，在侵染前期开始在寄主草莓的表皮下和细胞间生长，并在接种后3天左右转为细胞内坏死型生长(Zhang et al., 2020)。前期转录组测序结果表明CfE15基因在果生炭疽菌侵染草莓叶片过程中上调表达，由此推断该基因除了参与果生炭疽菌与草莓互作外，还可能与果生炭疽菌的生长发育有关。本研究构建了CfE15基因的缺失突变菌株△CfE15及互补菌株△CfE15C，孢子形态及产孢量测定发现，△CfE15的产孢量显著低于野生型菌株和互补菌株△CfE15C，互补菌株△CfE15C的孢子产量与野生型菌株无显著差异。菌落直径测量数据表明ΔCfE15的菌落直径与野生型菌株及互补菌株ΔCfE15C相比无显著差异。说明CfE15基因与果生炭疽菌的产孢能力有关。

由于CfE15蛋白不含任何已知的保守结构域，其生化功能还需要进一步分析。同时，关于CfE15基因在果生炭疽菌的生长发育及果生炭疽菌-草莓互作等方面具有的作用还有待进一步研究。

3材料与方法

3.1试验材料

本研究采用的果生炭疽菌(C. fructicola)野生型菌株由本实验室进行分离鉴定并保存；构建敲除载体及互补载体所用的质粒pKH-KO和pKN由中国农业科学院植物保护研究所张昊副研究员所在实验室提供。限制性内切酶购自New England Biolab公司；原生质体转化试剂自Sigma-ALDRICH公司。

3.2 CfE15基因片段的扩增

以实验室前期提取并保存的果生炭疽菌野生型RNA反转录得到的cDNA为模版，根据全基因组中的CfE15基因编码区序列，设计特异性引物CfE15F/ CfE15R (表1)扩增CfE15基因序列，回收该片段并测序。引物合成和测序工作均由上海生工生物工程有限公司完成。

3.3生物信息学分析

用ProtParam对CfE15蛋白的分子量大小及等电点进行分析；利用蛋白质家族数据库Pfam对CfE15蛋白的结构域进行分析，E-value 设为1e-05。通过SignalP 4.0预测CfE15蛋白的N端信号肽；通过PHYRE2 Server和SOPMA预测CfE15蛋白的二级结构；通过NetNGly1.0和NetPhos 3.1进行蛋白质的N-糖基化和N-磷酸化预测。

3.4果生炭疽菌CfE15基因敲除载体的构建

采用USER (uracil-specific excision reagent)技术一步构建敲除载体 (Frandsen et al., 2008)。根据果生炭疽菌基因组信息设计CfE15基因上游序列扩增引物E15UF/E15UR和下游引物E15DF/E15DR，并在引物的5′端分别添加O1、O2和O3、O4序列(表1)。以果生炭疽菌野生型菌株的DNA为模板，对上下游片段进行扩增，利用Pac I和Nt. BbvCI消化含有UCS序列的pKH-KO载体，通过USER酶在同一个连接体系中将上下游片段同源重组至pKH-KO载体中，反应体系及反应条件参照王晓亮等(2014)进行，从而获得CfE15基因的缺失载体。

3.5果生炭疽菌CfE15基因互补载体的构建

从NCBI数据库中获得CfE15基因的全长及其启动子和终止子信息，设计引物E15F+/E15R+(表1)扩增整个片段，两端加上载体接头。以果生炭疽菌的基因组DNA为模板扩增目的基因全长后连接到pKN载体的Kpn I/BamHI位点上，从而得到CfE15基因的互补载体。

3.6原生质体转化

参考Turgeon等(1987) PEG介导的原生质体转化方法，将线性化后的重组质粒进行原生质体转化，获得的转化子使用相应的抗生素(基因缺失载体: 潮霉素B/基因互补载体: 遗传霉素)进行抗性筛选。待相应的转化子长出，挑出转化子接到相应抗性的PDA平板上继续进行培养，转化子在PDA平板上长出后进行单孢分离，分离单孢方法参照张昊等(2008)，新长出的单个菌落转接到含相应抗生素的PDA平板上继续生长，后提取基因组利用特异性检测引物进行PCR鉴定。

3.7 CfE15基因敲除和互补转化子的PCR验证

选取阳性敲除转化子提取DNA，基因组DNA提取方法参照罗文(2015)。以C. fructicola野生型菌株为对照，进行PCR检测。检测方法如下：引物CfE15F和CfE15R：检测目的基因；引物H850和H852：检测替代目的基因的Hph基因；引物E15UF和E15DR：检测重组左右臂。

选取阳性互补转化子提取DNA，以C. fructicola野生型菌株和CfE15基因敲除菌株基因组为对照，利用特异的引物CfE15F/CfE15R进行PCR验证。

3.8野生型菌株、CfE15突变菌株及互补菌株基本生长情况的测定

用打孔器分别在野生型菌株、△CfE15和△CfE15C菌株上打取直径为9 mm的新鲜菌饼，接种于PDA培养基中心位置，每个菌株设置五个重复。在28℃恒温培养箱中培养7 d后用十字交叉法测量菌落直径，并记录菌落的生长形态。

3.9野生型菌株、CfE15突变菌株及互补菌株分生孢子形态及产量测定

用打孔器取9 mm大小的野生型菌株、△CfE15和△CfE15C菌株的新鲜菌饼若干，分别接种到含30 mL PDB培养基的50 mL锥形瓶中，28℃振荡培养2 d，过滤 5000 rpm离心8 min，收集分生孢子，将1×10³个分生孢子液转接至30 mL PDB培养基中，28℃振荡培养4~5 d，过滤收集分生孢子，对每个菌株产生分生孢子的数量进行计数。每个菌株都设置五个技术重复。

作者贡献

张丽勍是本研究的实验设计者和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；余永婷是原生质体转化试验的执行人，负责该部分的数据分析。方献平和李水根参与实验设计，试验结果分析；张学英负责指导实验设计、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由上海市科委启明星人才计划(18QB1402800)资助。

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